Ομαδοποίηση στελεχών γαλακτικών βακτηρίων απομονωθέντων απο τυρία μέσω της τεχνικής REP-PCR και ταυτοποίηση τους μέσω αλληλούχησης του 16s rDNA

Abstract

Στα μικρά τυροκομεία, όπως αυτά της Λήμνου, οι παραγωγοί εκμεταλλεύονται την παρουσία της ενδογενούς μικροχλωρίδας του γάλακτος για την παρασκευή τυριών, χωρίς τη χρήση εναρκτήριων καλλιεργειών. Αποτέλεσμα της συγκεκριμένης πρακτικής είναι να προκύπτουν τυριά τα οποία χαρακτηρίζονται από ιδιαίτερα, πιο έντονα και ευχάριστα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά. Αντικείμενο της συγκεκριμένης έρευνας αποτέλεσε η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός 112 οξυγαλακτικών βακτηριακών στελεχών μέσω της γενετικής ταυτοποίησης της μικροχλωρίδας δύο παραδοσιακών τυριών της νήσου Λήμνου, το Καλαθάκι και το Μελίχλωρο.Στη παρούσα εργασία έγινε γενετική ταυτοποίηση των οξυγαλακτικών βακτηριακών στελεχών που απομονώθηκαν από επτά δείγματα τυριών από τέσσερα τυροκομεία σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές του νησιού. Αρχικά, στα παραπάνω οξυγαλακτικά στελέχη πραγματοποιήθηκε ομαδοποίηση με τη μέθοδο της rep-PCR και τη χρήση του εκκινητή BOXAIR, που ενισχύει παλλίνδρομες διασκορπισμένες αλληλουχίες στο γονιδίωμα των οξυγαλακτικών βακτηρίων. Μέσω των φωτογραφιών των ηλεκτροφορήσεων μπόρεσαν να εξαχθούν συμπεράσματα για την ομαδοποίησητων στελεχών, με χρήση του προγράμματος BioΝumerics. Κατόπιν, με την ενίσχυση της αλληλουχίας 16S-rDNA επιλεγμένων στελεχών, έγινε ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους με τη χρήση του προγράμματος BLAST της βάσης δεδομένων του NCBI.Καταληκτικά επιτεύχθηκε ο χαρακτηρισμός και ο διαχωρισμός των στελεχών που συμμετέχουν στην οξυγαλακτική χλωρίδα των τυριών του κάθε παραγωγού. Τα αποτελέσματα αλληλούχησης των γονιδιωμάτων έδειξαν πως τα γαλακτικά βακτήρια για την παραγωγή τυριού Καλαθάκι, φαίνεται να αποτελούνται κατα πλειοψηφία βακτήρια της οικογένειας Enterococaceae του γένους Enteroccocus και είδους faecium. Επίσης ανιχνεύθηκαν και τα στελέχη P. pentosaceus, Lb. paracasei, L. garviae, E. gilvus, E. faecalis, P. acidilactici, Leuc. mesenderoides, Lb. acidipiscis, L. lactis και E. hirae σε μικρότερες αναλογίες. Αντίστοιχα, τα τυριά Μελίχλωρο περιλάμβαναν βακτήρια των οικογενειών Enterococaceae, Lactobacillaceae και Leuconostoccocaceae, με κυρίαρχα τα είδη E. faecium, P. pentosaceus, Lb. brevis και Leuc. mesenderoides για την κάθε οικογένεια αντίστοιχα. Επίσης ανιχνεύθηκαν και στελέχη απο τα είδη E. pseudoavium, Ε. avium και L. lactis σε μικρότερα ποσοστά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα αυτά, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα πως τα γαλακτικά βακτήρια με πιθανή προέλευση την αυτόχθονη μικροχλωρίδα του γάλακτος αλλά και την ενδογενή μικροχλωρίδα των χώρων τυροκόμησης και του εξοπλισμού εντός αυτών, φαίνεται να είναι υπεύθυνα για τη γαλακτική ζύμωση και τα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά στα τυριά που μελετήθηκαν. Επιλεγμένα στελέχη της μελέτης αυτής θα μπορούσαν να μελετηθούν περεταίρω για τη χρήση τους, ειδικά, ως εναρκτήριες καλλιέργειες για την παραγωγή των τυριών Καλαθάκι και Μελίχλωρο, όπως και γενικότερα για τη χρήση τους ως εναρκτήριες ή συμπληρωματικές καλλιέργειες γενικότερα στη ζύμωση των τροφίμων.

In small dairy industries as those of Lemnos, producers take advantage of the presence of wild microflora of milk in making cheese, excluding inoculation of starter cultures. As a result of this, cheeses are characterized by particularly intense and more pleasant organoleptic properties. The purpose of this research was the genetic identification of 112 lactic acid bacterial strains of two traditional cheeses of the island of Lemnos, ‘Kalathaki’ and ‘Melichloro’. In this research, it was executed genetic identification of bacterial strains which were collected from samples of seven cheeses, made from four different producers and whose milk came from sheep and goats, that grazed in different geographical locations of the island.Initially, the identification of the above mentioned lactic acid bacteria isolates was performed using rep-PCR with the primer BOXAIR, based on the multiple interspersed repetitive sequences that occupy dispersed sites throughout the bacterial genome. As a result, the electrophoretic patterns were used to prepare dendrograms using the program BioNumerics 6. By using this method we achieved the grouping of the strains. Then, the amplification of the 16S-rDNA of some selected strains was done and subsequently the identification of the strains using the program BLAST of the NCBI database. As a conclusion from the characterization and the separation of strains we can deduce information about which cultures were involved in the lactic acid microflora of each cheese.Our analysis showed that the majority of lactic acid bacteria of the ‘Kalathaki’ cheese was from the family of Enterococaceae, the genus Enteroccocus and the species faecium. In addition, the majority of lactic acid bacteria of the ‘Melichloro’ cheese, included strains of the Enterococaceae, Lactobacillaceae and Leuconostoccocaceae families, with dominant species being E. faecium, P. pentosaceus and Leuc. mesenderoides for each family, respectively. Interestingly, the secondary microflora of lactobacilli strains at those cheeses, was detected as well, including P. pentosaceus, Lb. paracasei, L .garviae, E. gilvus, E. faecalis, P. acidilactici, Leuc. mesenderoides, E. durans, Lb. acidipiscis, L. lactis and E. hirae from the ‘Kalathaki’ cheese. For the ‘Melichloro’cheese, lower numbers of the strains E. pseudoavium, E. avium, Lb. brevis and L. lactis were also detected. It can be concluded that the aforementioned strains derived from the natural microflora of raw milk and also the endogenous microflora of the cheese-making premises and equipment therein are responsible for the fermentation process and the unique organoleptic characteristics of these traditional cheeses. In the future, some selected strains of this study could be used as starter cultures to make the Kalathaki and Melichloro cheeses or to be used in general as starters for food fermentation.