Σύγκριση αποτελεσματικότητας διδύναμου εμπορικού και πειραματικών εμβολίων κατά της δονακίωσης και φωτοβακτηριδίασης στη τσιπούρα Sparus aurata (L.): διερεύνηση της ανοσολογικής αντίδρασης με τις μεθόδους ELISA και Western Blot

Abstract

Η φωτοβακτηριδίαση και η δονακίωση είναι δύο σημαντικές σηψαιμικές νόσοι των ψαριών που προκαλούνται από τα βακτήρια Photobacterium damselae subsp piscicida (εν συντομία Phdp, προηγουμένως Pasteurella piscicida) και Vibrio anquillarum (διάφοροι ορότυποι), αντίστοιχα. Προσβάλλουν σχεδόν όλα τα ευρύαλα εκτρεφόμενα και άγρια ψάρια με τη σοβαρότητα της εκδήλωσης των ασθενειών να εξαρτάται και από το είδος του ψαριού. Η πρόληψη των ασθενειών αυτών γίνεται, εκτός των διαχειριστικών μέτρων, με εμβολιασμό χρησιμοποιώντας διαθέσιμα εμπορικά εμβόλια. Η μελέτη αυτή έγινε με σκοπό τη σύγκριση της αποτελεσματικότητας ενός εμπορικού και δύο πειραματικών εμβολίων κατά της φωτοβακτηριδίασης και της δονακίωσης, καθώς και την διερεύνηση της ανοσολογικής αντίδρασης ποσοτικά, με την μέθοδο ανάλυσης ELISA και ποιοτικά με Western Blot. Τα εμπορικά εμβόλια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν το Alpha Ject 2000 (AJ) και το Aqua Vac Vibrio Pasteurella (AV). Και τα δύο είναι διδύναμα εμβόλια ως προς τα είδη βακτηρίων που περιέχουν (το Aqua Vac Vibrio Pasteurella τριδύναμο γιατί περιέχει δύο ορότυπους του V. anquillarum) και περιέχουν αδρανοποιημένες καλλιέργειες του βακτηρίου V. anquillarum (ορότυπος Ο1 ή/και Ο2) και του Phdp. Τα πειραματικά εμβόλια που χρησιμοποιήθηκαν είχαν ως εξής: το ένα (Eph) ήταν μονοδύναμο και περιείχε αδρανοποιημένες με φορμόλη καλλιέργειες μόνο του Phdp. Το δεύτερο (Evip) ήταν διδύναμο και περιείχε αδρανοποιημένες με φορμόλη καλλιέργειες των βακτηρίων V. anquillarum (ορότυπος Ο1) και Phdp. Στη παρούσα πτυχιακή θα παρουσιαστούν τα αποτελέσματα των πειραματικών μολύνσεων και της ποσοτικής ανάλυσης των ορών μόνο για το εμπορικό εμβόλιο AV και των πειραματικών εμβολίων Evip & Eph (καθώς το εμπορικό εμβόλιο AJ αποτέλεσε αντικείμενο άλλης πτυχιακής εργασίας) και τα αποτελέσματα της ποιοτικής ανάλυσης όλων των ορών που συλλέχθηκαν από όλες τις πειραματικές ομάδες. Η αποτελεσματικότητα των εμβολίων μελετήθηκε με πειραματικές μολύνσεις που έγιναν δύο μήνες μετά τον εμβολιασμό. Η πρώτη πειραματική μόλυνση με ενδοπεριτοναϊκή έγχυση έγινε με το βακτήριο V. anquilllarum και η δεύτερη έγινε την ίδια περίοδο με το Phdp. Το σχετικό ποσοστό επιβίωσης (RPS), όσον αφορά τη μόλυνση με το V. anquillarum, ήταν μεγάλο σε όλα τα εμβόλια, με το AV να επιτυγχάνει ποσοστό 92% και το Evip ποσοστό 100%. Αντιθέτως, στη μόλυνση με το Phdp, τα ποσοστά επιβίωσης δεν ήταν ικανοποιητικά. Το AV έδωσε αρνητικό ποσοστό, ενώ τα Eph και Evip 0%, αφού η θνησιμότητα ήταν ίδια ακριβώς με τα ψάρια μάρτυρες. Κατά τη διάρκεια ολόκληρου του πειράματος συλλέχθηκε αίμα από όλες τις ομάδες των εμβολιασμένων και εμβολιασμένων/μολυσμένων ψαριών και απομονώθηκε ο ορός. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των αντισωμάτων έγινε με την ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA). Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με τη χρήση του εργαλείου σταστιστικών υπολογισμών R μέσω εκτίμησης Kaplain – Meier και με χρήση των τεστ ANOVA και LSD. Στα εμβολιασμένα ψάρια με το V. anquillarum, τα εμβόλια AV και Evip προκάλεσαν τη παραγωγή τίτλων αντισωμάτων στα ίδια περίπου επίπεδα. Το ίδιο παρατηρήθηκε, στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα ψάρια με V. anquillarum για το κάθε εμβόλιο. Τα ψάρια μάρτυρες, όπως ήταν αναμενόμενο, είχαν τις χαμηλότερες τιμές τίτλων αντισωμάτων. Σημαντικά υψηλότερη στατιστική διαφορά στους τίτλους αντισωμάτων, μετρήθηκε για τις εμβολιασμένες ομάδες ψαριών που κατόπιν μολύνθηκαν σε σύγκριση με τις αντίστοιχες ομάδες των απλά εμβολιασμένων ψαριών. Αντίστοιχο μοτίβο παρατηρήθηκε και στα αποτελέσματα με το Phdp. Τα εμβόλια AV, Evip και Eph προκάλεσαν τίτλους αντισωμάτων περίπου στα ίδια επίπεδα. Στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα με Phdp ψάρια οι μάρτυρες είχαν τις χαμηλότερες τιμές τίτλων αντισωμάτων. Όπως και στην ανάλυση με το V. anquillarum, οι εμβολιασμένες ομάδες ψαριών που στη συνέχεια μολύνθηκαν με το Phdp, είχαν σημαντικά υψηλότερη στατιστική διαφορά στους τίτλους αντισωμάτων που μετρήθηκαν σε σχέση με τις αντίστοιχες απλά εμβολιασμένες ομάδες, με εξαίρεση την ομάδα εμβολίου Evip, όπου δεν διαπιστώθηκε στατιστική διαφορά. Οι αυξημένοι τίτλοι αντισωμάτων μετά την πειραματική μόλυνση πιθανά να συνδέονται με την ανάπτυξη ανοσολογικής μνήμης. Η ποιοτική ανάλυση των αντισωμάτων έγινε με την ανοσοχημική μέθοδο Western Blot. Στα εμβολιασμένα ψάρια με το V. anquillarum, παρατηρήθηκε αντίδραση με αντιγόνα του βακτηριακού κυττάρου με, κατά πάσα πιθανότητα, φυσικά αντισώματα που υπάρχουν στον ορό των ψαριών. Αυτό παρατηρήθηκε σε όλες τις δοκιμές WB και εντύπωση προκαλεί το γεγονός ότι οι αντιδράσεις ήταν ίδιες τόσο στα εμβολιασμένα όσο και στα ψάρια μάρτυρες, εύρημα που συνηγορεί με την ύπαρξη φυσικών αντισωμάτων ή με την επαφή των ψαριών με τον μικροοργανισμό, επιπλέον των εμβολιασμών. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε έντονη αντίδραση με αντιγόνα λιποπολισακχαριδικής φύσης στο μοριακό βάρος των 54kD, με αμέσως επόμενο το μοριακό βάρος λίγο πιο πάνω από τα 15 kD. Στα εμβολιασμένα ψάρια παρατηρήθηκαν σε γενικές γραμμές ομοιόμορφες αντιδράσεις για όλες τις εμβολιακές ομάδες, αλλά και για τα ψάρια μάρτυρες, όμως το διδύναμο πειραματικό εμβόλιο EVIP στις ημέρες 65 και 72 ξεχωρίζει επειδή δίνει πιο αδύναμες αντιδράσεις σε συγκεκριμένα μοριακά βάρη (54-41kD, 27.5kD και 20.7kD) από τις υπόλοιπες ομάδες. Το ίδιο παρατηρείται και για την ομάδα των μαρτύρων αλλά και για το εμπορικό εμβόλιο AJ για την ημέρα 87 στο μοριακό βάρος 27.5kD. Στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα ψάρια με V. anquillarum παρατηρήθηκαν παρόμοιες αντιδράσεις με αυτές των εμβολιασμένων στις πρώτες μέρες της μόλυνσης, ενώ προς το τέλος του πειράματος υπήρξε διαφοροποίηση στα δύο εμπορικά εμβόλια. Συγκεκριμένα, για το εύρος ημερών 8-12 υπάρχει κλιμακωτή αύξηση της αντίδρασης των αντισωμάτων για το μοριακό βάρος λίγο πιο πάνω από 15kD και μεμονωμένες αντιδράσεις των εμβολίων AJ και AV για τα μοριακά βάρη 41kD – 27.5kD. Στην ανάλυση Western Blot για τα εμβολιασμένα ψάρια με το Phdp υπήρξε πολύ έντονη αντίδραση αντιγόνων των βακτηριακών κυττάρων με φυσικά αντισώματα και σε αυτές τις αναλύσεις σε διαφορετικά όμως μοριακά βάρη σε σύγκριση με το προηγούμενο βακτήριο. Αξιοσημείωτη είναι η εικόνα που παρουσιάζει το εμπορικό εμβόλιο Alpha Ject 2000, όπου δίνει ξεχωριστές (σε σύγκριση με τα υπόλοιπα εμβόλια ) αντιδράσεις, κατά μήκος όλης της στήλης στις μεμβράνες. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι το ανοσοενισχυτικό που περιλαμβάνεται στο εμβόλιο δρα κατά επωφελή τρόπο προς την παραγωγή αυξημένων επιπέδων αντισωμάτων και αντισωμάτων έναντι περισσότερων αντιγόνων του μικροοργανισμού. Συγκεκριμένα, υπήρξε έντονη αντίδραση με αντιγόνα λιποπολισακχαριδικής φύσης στα μοριακά βάρη 20.7-15kD. Το εμπορικό εμβόλιο Alpha Ject έδινε ξεχωριστές αντιδράσεις σε σύγκριση με τις υπόλοιπες εμβολιακές ομάδες με εντονότερη να είναι αυτή στα 6.4kD. Αντιδράσεις παρατηρήθηκαν επίσης στα μοριακά βάρη 193-102kD (αντιγόνα λιποπολισακχαριδικής φύσης), 102-54kD και 27.5kD. Στα εμβολιασμένα και κατόπιν μολυσμένα ψάρια με Phdp υπήρξε παρόμοια εικόνα με αυτή των εμβολιασμένων. Αντιδράσεις δίνει και το εμπορικό εμβόλιο Alpha Ject 2000 ακολουθώντας μία φθίνουσα πορεία μέχρι το τέλος του πειράματος. Το εμπορικό εμβόλιο Alpha Ject έδωσε ξεχωριστές αντιδράσεις σε σύγκριση με τις υπόλοιπες εμβολιακές ομάδες με πιο αξιοπρόσεκτη να είναι αυτή στα 6.4kD. Αχνές αντιδράσεις παρατηρούνται και στα μοριακά βάρη ανάμεσα σε 193-102kD (αντιγόνα λιποπολισακχαριδικής φύσης), 102-54kD και 27.5kD. Η ύπαρξη και λειτουργία των φυσικών αντισωμάτων, έγινε εμφανής στην ανάλυση των δειγμάτων. Τα φυσικά αντισώματα έχουν την δυνατότητα να προσκολλώνται σε συγκεκριμένα αντιγόνα ή παθογόνα, ακόμα και αν ο ξενιστής δεν έχει εκτεθεί ποτέ σε περιβάλλον που να υπάρχει ο μικροοργανισμός.

Photobacteriosis and vibriosis are two important septicemic fish diseases that are caused from the bacteria Photobacterium damselae subsp piscicida and Vibrio anquillarum (different serotypes), respectively. The aim of this study was the analysis of the specific humoral immune response of sea bream, Sparus aurata (L.), against Vibrio anguillarum O1 and Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) after vaccination with commercial and experimental bacterins, quantitatively and qualitatively. Specific anti-V. anguillarum O1 and anti-Phdp levels provoked by the adjuvanted commercial vaccine reached higher levels in comparison to the aqueous commercial and experimental bacterins. Infection of vaccinated fish with V. anguillarum O1 bacterial cells acted as a boost of the humoral immune response. When vaccinated groups were infected with Phdp, infection acted as boost of the humoral immune response mainly for the group vaccinated with a monovalent Phdp bacterin and to a lesser degree for the group vaccinated with the aqueous commercial vaccine. Western blot analysis of the sera against V. anguillarum O1 whole cell antigens revealed strong reactions to only a few antigens at below 54kD and above 15kD and weak reactions to other antigens. Similar reactions were observed from the sera isolated from the controls. An additional reaction against an antigen between 41kD and 27.5kD was noted from sera isolated from the infected fish of the groups immunized with the commercial formulations. Western blot analysis of the sera against Phdp whole cell antigens revealed strong reactions to only a handful of antigens below 20.7kD and below 6.4kD and weak reactions against other antigenic material. Only the sera isolated from the group immunized with the adjuvanted commercial vaccine showed reactions against the complete range of the aforementioned antigens, both quantitatively and qualitatively. Sera from the control group, as in the case of V. anguillarum O1, reacted with Phdp whole cell antigens. No differences between monovalent and bivalent formulations was noted, in contrast to the adjuvanted and aqueous bacterins.