Μοριακή ταυτοποίηση βακτηρίων που απομονώθηκαν από σφήκες μέσω αλληλούχισης ριβοσωμικών 16S rRNA γονιδίων

Abstract

Οι σφήκες αποτελούν μία από τις γνωστότερες κατηγορίες εντόμων με τις οποίες αλληλεπιδρά ο άνθρωπος μιας και οι δραστηριότητές τους σε πολλές περιπτώσεις πραγματοποιούνται ταυτόχρονα στον ίδιο χώρο. Οι μικροοργανισμοί οι οποίοι εντοπίζονται γενικά στις σφήκες, εσωτερικά και εξωτερικά, διαμορφώνονται, κυρίως, από το περιβάλλον και τις διατροφικές επιλογές της εκάστοτε σφήκας. Η πιθανή παρουσία και μεταφορά παθογόνων αποτελεί τον κύριο λόγο για τον οποίο απαιτείται η ανάλυση του μικροβιακού φορτίου ορισμένων ειδών κοινωνικών σφηκών, ώστε να καθοριστεί το μέτρο της ασφάλειας της συνύπαρξης τους με τον άνθρωπο. Για τον σκοπό αυτό, στη συγκεκριμένη μελέτη απομονώθηκαν 47 μικροβιακά δείγματα (αποικίες βακτηρίων) από σφήκες που συλλέχθηκαν από ποικίλα ενδιαιτήματα του νησιού της Λήμνου και από διαφορετικά τμήματα του σώματος της κάθε σφήκας ώστε να ταυτοποιηθούν. Η αρχική απομόνωση των βακτηρίων έγινε χρησιμοποιώντας επιλεκτικά θρεπτικά υλικά, ενώ τα απομονωθέντα δείγματα κατηγοριοποιήθηκαν αρχικά με βάση τα αποτελέσματα χρώσης κατά Gram και δοκιμής καταλάσης. Για την ταυτοποίηση των βακτηρίων επιλέχθηκε να πολλαπλασιαστεί και στη συνέχεια να αλληλουχηθεί πλήρως το γονίδιο 16S rDNA. Για το σκοπό αυτό, τα δείγματα, αρχικά, υποβλήθηκαν σε διαδικασία απομόνωσης του γονιδιωματικού DNA από το καθένα και ποσοτικοποίησής του ώστε να μπορέσει ακολούθως να πολλαπλασιαστεί το συγκεκριμένο γονίδιο μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας καθολικούς εκκινητές (universal primers). Η οπτικοποίηση των αμπλικονίων της PCR έγινε μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτή αγαρόζης. Έπειτα, το κάθε δείγμα αφού καθαρίστηκε στάλθηκε για πλήρη αλληλούχιση κατά Sanger στα εργαστήρια του EKETA. Τα αποτελέσματα της αλληλούχισης για κάθε δείγμα (βακτηριακή απομόνωση) διασταυρώθηκαν εν τέλει με βάση δεδομένων νουκλεοτιδικών αλληλουχιών με χρήση του λογισμικού BLAST ώστε να γίνει η τελική ταυτοποίηση (σε επίπεδο είδους). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στα 47 δείγματα, τα κυρίαρχα γένη ήταν Enterococcus (περίπου 38%), Proteus (32%) και σε μικρότερο βαθμό εντοπίστηκαν τα γένη Enterobacter (10,6%), Staphylococcus (6,3%), Klebsiella (2%), Gibbsiella (2%), Lactobacillus (2%) και Lactococcus (2%). Τα τελικά αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την αρχική υποψία περί πιθανής μεταφοράς παθογόνων μικροοργανισμών από τις σφήκες, καθώς στα δείγματα που στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν εντοπίστηκαν είδη σημαντικών ευκαιριακών παθογόνων (πχ Proteus mirabilis) καθώς και δείκτες εντερικών παθογόνων όπως κολίμορφα βακτήρια (Enterobacter, Klebsiella) και εντερόκοκκοι, γεγονός που αναδεικνύει τον κίνδυνο που πιθανώς να διατρέξει ο άνθρωπος σε περίπτωση επαφής με σφήκα. Η μέθοδος αλληλούχισης του γονιδίου 16S rDNA, παρόλο που έδωσε ικανοποιητικά ευρήματα, για ορισμένα δείγματα (συγκεκριμένα για 7 από τα 47) σημειώθηκαν και αποτελέσματα όπου η ταυτοποίηση μπόρεσε να επιτευχθεί μόνο μέχρι το επίπεδο του γένους (και όχι είδους), συνεπώς για ακριβέστερη ταυτοποίηση απαιτείται η χρήση εναλλακτικών μεθόδων (πχ MALDI-TOF, API, species-specific PCRs).