Σχετική ποσοτικοποίηση έκφρασης γονιδίων μολυσματικότητας σε βιοϋμενικά κύτταρα Listeria monocytogenes εν συγκρίσει με πλαγκτονικά

Abstract

Η Listeria monocytogenes είναι ένα προαιρετικά ενδοκυτταρικό παθογόνο θετικό κατά Gram βακτήριο το οποίο προκαλεί μία σοβαρή τροφιμογενή λοίμωξη γνωστή ως διεισδυτική λιστερίωση σε άτομα που ανήκουν σε ευάλωτες ομάδες, όπως τα νεογνά, οι ηλικιωμένοι, οι έγκυες γυναίκες και τα ανοσοκατεσταλμένα άτομα. Καθώς το συγκεκριμένο βακτήριο συναντάται σε ποικίλα ενδιαιτήματα, όπως το χώμα και το νερό, μπορεί αρκετά εύκολα να εισέλθει σε εγκαταστάσεις παραγωγής και επεξεργασίας τροφίμων, όπου μπορεί να προσκολλάται πάνω σε διάφορες επιφάνειες σχηματίζοντας δομές που ονομάζονται βιοϋμένια. Αυτά ορίζονται ως οι δυναμικά πολύπλοκες κοινότητες μικροοργανισμών που προσκολλώνται σε επιφάνειες και ενσωματώνονται σε αυτοπαραγόμενες εξωκυτταρικές πολυμερείς ουσίες. Έχει προταθεί ότι εντός αυτών των δομών, τα κύτταρα L. monocytogenes όχι μόνο εμφανίζουν αυξημένη ανοχή στο στρες, αλλά μπορεί επίσης να ενισχύσουν την παθογένειά τους. Η συγκεκριμένη μελέτη είχε ως στόχο τη διερεύνηση της έκφρασης δέκα σημαντικών γονιδίων μολυσματικότητας ή/και απόκρισης στο στρες (groEL, hly, iap, inlA, inlB, lisK, mdrD, mdrL, prfA, και sigB) σε τρία διαφορετικά στελέχη L. monocytogenes (DFSNB71, DFSN_B74 και DFSN_B96), το καθένα από τα οποία ανήκει σε διαφορετικό ορότυπο που έχει συσχετιστεί με την πρόκληση λιστερίωσης (1/2a, 1/2b και 1/2c, αντίστοιχα), υπό συνθήκες σχηματισμού βιοϋμενίου. Για τον σκοπό αυτό, κάθε στέλεχος αρχικά αναπτύχθηκε σχηματίζοντας βιοϋμένιο πάνω σε πρότυπη επιφάνεια πολυστυρενίου (τρυβλίο Petri) στους 20 °C για 144 ώρες (6 ημέρες) σε θρεπτικό ζωμό τρυπτικάσης σόγιας (με ανανέωση του θρεπτικού υλικού κάθε 48 ώρες). Ακολούθως της επώασης, συλλέχθηκαν τα βιοϋμενικά και τα αντίστοιχα μη προσκολλημένα (πλαγκτονικά) κύτταρα, από τα οποία απομονώθηκε το ολικό RNA. Τα RNAs αυτά υπέστησαν αντίστροφη μεταγραφή προς τα συμπληρωματικά τους cDNAs, τα οποία ακολούθως χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα σε αλυσιδωτές αντιδράσεις πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR), με τελικό στόχο τη σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης των δέκα γονιδίων μεταξύ των βιοϋμενικών και πλανγκτονικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν μία διαφορική έκφραση των γονιδίων στόχων μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων, η οποία εξαρτιόταν σημαντικά από το στέλεχος του παθογόνου. Συγκεκριμένα, ο σχηματισμός βιοϋμενίου από το στέλεχος DFSN_B74 (ορότυπος 1/2b) οδήγησε σε μία ανησυχητική υπερέκφραση όλων των γονιδίων (Ρ < 0.05), ενώ η έκφραση των περισσότερων γονιδίων (8/10) του στελέχους DFSN_B96 (ορότυπος 1/2c) παρέμεινε σταθερή, με εξαίρεση τα γονίδια groEL και hly, τα οποία και πάλι παρουσίασαν σημαντική υπερέκφραση. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης εμπλουτίζουν τις γνώσεις μας όσον αφορά τη φυσιολογία των κυττάρων L. monocytogenes υπό συνθήκες σχηματισμού βιοϋμενίου που μπορούν επίσης να απαντώνται σε περιβάλλοντα παραγωγής και επεξεργασίας τροφίμων. Επιπλέον, η γνώση σχετικά με τις διαφορές μεταξύ των στελεχών του παθογόνου όσον αφορά την απόκριση στο στρες, καθώς και της μολυσματικής του δράσης κατά το σχηματισμό βιοϋμενίου μπορεί να αξιοποιηθεί για το σχεδιασμό καινοτόμων και αποτελεσματικότερων μεθόδων εξάλειψης των βιοϋμενίων, και ως εκ τούτου να συμβάλλει στην προστασία των καταναλωτών και της δημόσιας υγείας.

Listeria monocytogenes is a facultatively intracellular pathogenic Gram-positive bacterium that can provoke a severe foodborne infection known as invasive listeriosis in vulnerable population groups, such as infants, the elderly, pregnant women and immunocompromised individuals. As this particular bacterium is found in a variety of habitats, such as soil and water, it can quite easily enter food production and processing facilities, where it may attach itself onto various surfaces forming structures called biofilms. These are defined as dynamically complex communities of microorganisms that adhere to surfaces and integrate into self-produced extracellular polymeric substances. It has been suggested that within these structures, L. monocytogenes cells not only exhibit increased stress tolerance, but may also enhance their pathogenicity. This particular study aimed to investigate the expression of ten key virulence and/or stress response genes (groEL, hly, iap, inlA, inlB, lisK, mdrD, mdrL, prfA, και sigB) in three different strains of L. monocytogenes ( DFSNB71, DFSN_B74 and DFSN_B96), each belonging to a different listeriosis-associated serotype (1/2a, 1/2b and 1/2c, respectively), under biofilm-forming conditions. To that end, each strain was initially grown while forming a biofilm on a model polystyrene surface (Petri dish) at 20 °C for 144 h (6 days) in soy trypticase nutrient broth (with medium renewal every 48 hours). Following incubation, both biofilm and the surrounding free-swimming (planktonic) cells were recovered from which total RNA was isolated. These RNAs were reverse transcribed to their complementary cDNAs, which were subsequently used as substrates in real-time polymerase chain reactions (qPCR), with the ultimate goal of comparing the gene expression of the ten genes between biofilm and planktonic cells. Results revealed a strain-dependent differential gene expression between the two cell types. Thus, for instance, in strain DFSN_B74 (ser. 1/2b) biofilm growth worryingly resulted in a significant overexpression of all the studied genes (P < 0.05), whereas in strain DFSN_B96 (ser. 1/2c), the expression of most genes (8/10) did not change upon biofilm growth, with only groEL and hly being again significantly upregulated. The results of this study enrich our knowledge regarding the physiology of L. monocytogenes cells under biofilm-forming conditions that can also be found in food production and processing environments. At the same time, the knowledge regarding the strain-dependent differences of the pathogen’s response to stress, as well as its virulence, during biofilm formation can be exploited in order to design innovative and more effective methods to eliminate biofilms, which can therefore contribute to the protection of consumers and public health.